人成纤维细胞生长因子受体2iiic及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2iiic(fgfr2iiic)及其s252w突变型重组腺病毒，感染乳腺癌细胞mda-mb-231，为下一步研究fgfr2iiic基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含fgfr2iiic基因的质粒为模板，pcr扩增得到fgfr2iiic基因，重叠延伸法pcr获得fgfr2iiics252w突变型基因；分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv上，得到重组穿梭质粒padtrack-fgfr2iiic和padtrack-fgfr2iiics252w，dna测序证实。pmei酶切后分别与腺病毒骨架质粒padeasy-1共转化bj-5183感受态细菌同源重组，得到的重组表达质粒ad-fgfr2iiic和ad-fgfr2iiics252wpaci酶切线性化后转染hek293a细胞进行重组腺病毒的包装和扩增，通过gfp报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度，进一步感染乳腺癌细胞mda-mb-231，rt-pcr和westernblotting方法检测目的基因的表达，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明，成功构建了人fgfr2iiic及其s252w突变型基因的重组腺病毒表达载体，获得的重组腺病毒颗粒能高效感染mda-mb-231细胞，并表达目的基因。mtt结果显示fgfr2iiic和s252w均能抑制mda-mb-231细胞增殖，s252w抑制效果更加明显。流式细胞术表明fgfr2iiic和s252w均能使mda-mb-231细胞周期停滞于g0/g1期，抑制细胞增殖。