用基于“neo/e”的技术构建重组质粒

根据重组工程原理，建立了一种用于构建重组质粒的“neo/e”（抗生素/单酶切位点）选择与反选择新方法。首先采用pcr方法扩增出线性打靶分子：然后进行两步体内同源重组，（1）neo/e基因敲入，重组子呈现neo抗性表型；（2）目的基因替换neo/e基因。用限制酶e消化时，发生第二步重组的dna分子不能被消化，能够转化大肠杆菌受体菌dh5α。应用该方法构建了重组质粒pgl3-basicpc1900t。pcr及测序鉴定证明：外源片段重组率为20%，所建立的重组工程选择与反选择新技术为质粒构建提供了新的解决方案。