3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9α-羟基雄烯二酮的制备

9α-羟基雄烯二酮(9-oh-ad)是制备甾体类药物的重要中间产物。3-甾酮-9α-羟基化酶(ksh)能够转化雄烯二酮(ad)产生9α-羟基雄烯二酮(9-oh-ad)，该酶由ksha和kshb两个亚基构成。为获得高效积累9-oh-ad的重组菌株，本研究选择耻垢分枝杆菌mycobacteriumsmegmatismc2155和戈登氏菌gordonianeofelifaecisnrrlb-59395，对其在胆固醇为唯一碳源条件下表达明显上调的ksha和kshb候选基因进行克隆，插入到分枝杆菌表达载体pnit中，构建共表达质粒，并将它们导入分枝杆菌mycobacteriumsp.nrrlb-3805中，获得重组菌株。利用重组菌株分别对植物甾醇、胆固醇和谷甾醇进行生物转化，分离纯化转化产物，采用光谱学方法鉴定其化学结构，确定该转化产物为9α-羟基雄烯二酮，说明分枝杆菌mycobacteriumsp.nrrlb-3805由积累雄烯二酮变为积累9α-羟基雄烯二酮(9-oh-ad)，进而证明导入的候选基因ksha和kshb确实为有功能的基因。生物转化实验表明，与胆固醇、谷甾醇相比，植物甾醇作为底物更易于转化；而用来源于耻垢分枝杆菌的ksha、kshb构建的重组菌转化率更高，可达90%，具有较高的应用价值。本研究通过对ksh编码基因的异源表达，成功地进行了分枝杆菌生物转化特性的改造，为探索各种甾体药物中间体的工业生产奠定了基础。