牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰盖鬼伞中的组合表达

紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物，是一种重要的新型抗癌药物。然而，紫杉醇在植物中含量低且难提取，限制了高效应用。利用基因工程手段，借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径，构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate,ggpp)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体pbgggts和独立表达盒表达载体pbggggts，并分别转入灰盖鬼伞lt2菌株中，经过选择性筛选、pcr鉴定、southernblotting杂交验证，分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株，分别提取菌丝体和发酵液分析。gc-ms分析表明，两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰，而与出发菌株的发酵液提取物相比，两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰，采用gc-ms特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯，分别为44ng/l(转化pbggggts)和30ng/l(转化pbgggts)。结果表明，通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因，可以生物合成紫杉二烯。