ppenk-midge-nls基因载体的构建及其在活体大鼠的表达

增加体内免疫细胞合成分泌内源性阿片肽，可对心肌缺血再灌注损伤产生保护作用。基因治疗是增加内源性脑啡肽(enkephalin,enk)的一种有前景的研究方向，但是以往的病毒、质粒等载体受到其自身免疫原性的限制并存在基因重组、原癌基因激活、抗细菌蛋白抗体产生以及基因表达改变等诸多问题。本研究采用非病毒、非质粒的微量免疫原定义的基因表达(minimalisticimmunologicaldefinedgeneexpression,midge)方法构建前脑啡肽原(preproenkephalin,ppenk)ppenk-midge-nls基因载体能克服病毒和质粒载体的上述缺点。用pcr技术扩增大鼠前脑啡肽原(preproenkephalin,ppenk)外显基因，产物插入pegfp-n1质粒，双酶切质粒获得包含启动子、目的基因、rna稳定序列的线性载体，两端以不受外切酶作用的发夹样脱氧寡核苷酸序列(oligodesoxynucleotides,odns)封闭。为保证载体的入核和表达效率，载体的一端连接了核定位序列(nuclearlocalizationsequence,nls)。流式细胞术和激光共聚焦检测其转染效率，westernblotting检测组织内前脑啡肽蛋白的表达。结果显示，ppenk-midge-nls能够转染大鼠活体细胞并表达前脑啡肽蛋白，增加载体的量能够在一定范围内提高转染效率。研究结果表明该载体可能成为预防和治疗心肌缺血再灌注损伤的新方法。