16srdna用作荧光定量pcr靶基因快速检测铜绿假单胞菌

对20余种细菌16srdnas进行多序列比对与进化树分析，设计铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa,pa）荧光定量pcr（fluorescencequantitativepcr，fqpcr）特异性引物。提取pa基因组dna，以特异性引物扩增16srdna靶片段，并构建重组质粒pmdtpfr。将梯度稀释的pmdt-pfr质粒作为模板，用于建立定量标准曲线。以sybrgreeni荧光染料建立20μl反应体系，对不同浓度的padna样品进行fq-pcr检测。同时，以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组dna作阴性对照，验证fq-pcr方法检测pa的特异性。结果显示，设计的fq-pcr引物的靶向序列，仅对pa16srdna有高度同源性；fq-pcr方法检测pa，其灵敏度达3.6pg/μl的基因组dna或（2.1×103±3.1×102）拷贝/μl的16srdna基因，并且具有很强的特异性；从细菌dna提取到fq-pcr检测，可在2h左右完成pa鉴定。较传统的培养鉴定法而言，以16srdna作为fq-pcr靶基因快速检测pa，具有很好的研究价值与应用前景。