台湾家白蚁内切葡聚糖酶活性中心氨基酸的饱和突变

对内切葡聚糖酶的功能改进一直是纤维素酶研究领域的焦点。本研究对台湾家白蚁内切葡聚糖酶(cfeg)的活性位点做了饱和突变。首先,以pdb数据库中高山象白蚁内切葡聚糖酶(nteg)的三维结构(pdbid=1ks8)为模板,对cfeg进行三维结构同源建模,二者序列一致性高达79%。位于cfeg活性中心的d53、d56、e411,分别与nteg的催化残基d54、d57、e412重合。用简并引物对cfeg的假定活性位点d53、d56、e411进行定点饱和突变。在位点d53、d56各筛选到羧甲基纤维素酶活有一定提高的突变子d53e、d56c,其中d56c的km值减小为原始酶的三分之一。双突变子d53l/d56i的比活比原始酶提高了近2倍,同时km值减小至原始酶的一半。而e411的饱和突变子库均没有活性,进一步将其替换为近似氨基酸的e411d、e411q定点突变子也丧失了酶活。由突变结果可推断,位点e411为该酶行使功能的必需残基。