链霉菌基因克隆载体及基因文库的构建

利用麦迪霉素产生菌中分离的质粒psmy1(10．8kb)，将pij30的硫链丝菌素抗性基因(tsr)克隆到psmy1上，获得了具有硫链丝菌素抗性选择标记质粒psj10。通过dna体外缺失，片段播入、λ-cos片段的插入及与大肠杆菌质粒的重组等基因技术，获得了一系列psmy1衍生质粒，包括双标记质粒psm3，大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒pbmj2和穿梭粘粒pnmj1。通过对这些质粒的分析，确定了质粒psmy1的复制必需区为3．06kd的ecori—sphi片段。质粒psj10、psm3、pnmj1具有可选择标记，多个单一确切的可克降位点，有一定范围的宿主并能在链霉菌中稳定存在等特点，故可作为链霉菌基因克隆的载体。其中pnmjl(11．15kb)是大肠杆菌／链霉菌穿梭粘粒，能有效地运载28—38kb的外源dna片段，并能在体外包装λ噬菌体外壳，转导大肠杆菌。利用载体pnmjl，通过λ-噬菌体蛋白体外包装，在大肠杆菌中建立了螺旋霉素产生菌的基因文库，其基因覆盖率可达90％。重组dna分子可通过转化转移到链霉菌中。