基于哺乳动物单杂交技术erα调节剂高通量筛选模型的建立及应用

雌激素受体α(estrogenreceptorα,erα)是一种类固醇核受体,在机体的多种生理功能中起关键作用。为了筛选新的erα调节剂,本研究建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因技术的高通量erα调节剂筛选模型。利用rt-pcr技术从脂肪组织总rna中扩增erα配体结合区(ligandbindingdomain,erαlbd)基因序列,并插入含gal4dna结合域的pbind-gal4表达质粒构建pbind-gal4-erα(lbd)的嵌合表达质粒。该质粒与本室已构建好的含gal4响应元件和荧光素酶的报告质粒pgl3-gal4共转染,通过测定荧光素酶的活性评价er调节剂的转录调剂的活性。经过多种条件优化,激动剂阳性药对照雌二醇可以剂量依赖地诱导荧光素酶的表达,最大上调倍增数可达28.1倍,ec50为0.17mmol/l。拮抗剂阳性对照它莫昔芬可以有效地拮抗雌二醇的活性,最大下调倍数为6.3倍,ec50为0.1mmol/l。该筛选模型可微量化于384孔板,且z'因子均大于0.5。利用该模型从2000多个微生物和植物来源的天然产物以及合成化合物中筛选得到4个erα激动剂。该模型灵敏、稳定,可以快速进行多种来源的erα调节剂的筛选和活性评价。