豇豆胰蛋白酶抑制剂cdna在大肠杆菌中的克隆与表达

从即将成熟的豇豆予叶中分离出总rna，逆转录合成cdna第一条链。参照已知的几种bowman—birk型胰蛋白酶抑制剂基因序列，设计并合成了两段寡核苷酸引物，以单链cdna为模板，进行pcr扩增，得到320bp的均一扩增产物，克隆到pbluescripsk(+)的ecorv位点上并转化大肠杆菌jm101。酶切图谱及dna序列分析表明克隆到的片段含有编码完整80个aa的豇豆胰蛋白酶抑制剂结构基因和一段编码27aa的前导序列。利用限制酶ncoi对其前导序列进行缺失，只保留成熟蛋白结构基因上游第一个atg密码子并克隆到大肠杆菌表达载体pkk233—2中进行表达研究，从转化细菌的提取物中检测到了外源cptj基因表达产物对胰蛋白酶的抑制活力。