血管性血友病因子裂解蛋白酶的稳定表达及其活性检测

本研究旨在得到重组的血管性血友病因子裂解蛋白酶(adamts13)，进一步研究其在血栓止血中的作用。利用脂质体将编码adamts13全长序列的重组质粒psectag-adamts13转染hela细胞，用潮霉素(hygromycin-b)筛选得到阳性克隆细胞株，并扩大培养，收集上清。利用ni-nta琼脂糖柱、梯度咪唑淋洗法纯化蛋白，sds-page和westernblotting鉴定纯化产品纯度和免疫学活性，采用gst-his双抗夹心法测定蛋白剪切活性。结果显示，成功获得一株能恒定分泌重组adamts13蛋白的细胞株adamts2-4，每1l培养上清可纯化得到5.8mg重组蛋白。westernblotting结果显示，adamts13多抗能与重组蛋白在190kda处显单一条带，并且蛋白具有6.4u/ml的剪切活性(每毫升正常人混合血浆中adamts13活性为1u)。重组蛋白具有较好的免疫原活性和酶活性，为进一步研究adamts13作用机理和运用奠定了良好的基础。