靶向hiv-1pol的高效人工mirna的构建与体外抗病毒能力评价

rnai技术在抗hiv-1治疗研究中已显示出巨大潜力，获得可高效特异抑制hiv-1的rnai元件是进行相关研究的重要基础。mirna在抑制和表达方式上相比sirna具有更多的优势。本研究即探讨构建可高效特异靶向hiv-1的人工mirna元件。选择以保守性较好的hiv-1pol基因为靶区筛选高效保守的rnai序列，设计了16个可靶向pol区高保守区段的rnai靶点，构建表达载体与hiv-1感染性克隆进行共转染抑制实验，筛选显示pol1026序列兼具高保守性及高抑制效率特点。以天然mir-30a为基础骨架构建了靶向pol1026靶点的人工mirna元件，通过与hiv-1感染性克隆质粒的共转染抑制实验验证获得了可有效抑制hiv-1表达的人工mirna元件(mir-1026e)。通过与携带靶序列的报告质粒的共转染实验证明mir-1026e具有良好的靶点特异性。本研究进一步构建了携带mir-1026e表达元件的重组慢病毒，转导mt-4细胞并对转导后细胞进行克隆化筛选，获得稳定整合mir-1026e表达元件的mt-4-mir1026e细胞克隆，该细胞在体外攻毒实验中可高效抑制hiv-1的复制，具有显著的抑制hiv-1的能力。同时应用实时rt-pcr方法检测显示，mir-1026e在细胞中不会影响内源性代表mirna(mir-181与mir-16)的表达水平和干扰素效应相关基因stat1的表达水平，具有良好的特异性。所获得的可特异高效抑制hiv-1复制的人工mirna元件可为抗hiv-1研究提供重要参考。