(s)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表达

本实验室筛选出一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株nk13为材料，经鉴定为巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)。通过构建其基因文库，从中筛选得到阳性克隆重组子puc-nk1。测序分析表明，该重组子质粒中包含一长度为633bp的脂肪酶基因的完整开放阅读框，核苷酸同源性对比证明该脂肪酶基因属首次发现(genbankaccessionno.eu381317)，将此基因克隆到原核表达载体pet21b(+)中构建重组表达质粒pet-nkest1，转化escherichiacolibl21，经isopropyl-β-d-thiogalactoside(iptg)诱导在宿主菌中得到表达，经sds-page电泳检测证明该脂肪酶成熟蛋白分子量约为20kda。薄层层析与hplc检测结果显示，表达菌株转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯得到(s)-酮基布洛芬过量(e.e.％)，由野生菌nk13的5.84％提高到75.28％，提高约15倍，说明该脂肪酶具有优先拆分得到(s)-酮基布洛芬的特性。