人β-分泌酶(bace1)在毕赤酵母中分泌表达及纯化

为了获得活性良好的重组人β-分泌酶(β-secreatase,bace1)，用于研究其与抑制剂的作用模式，构建了携带β-分泌酶probace1和bace1编码序列的重组表达质粒ppic9k-metbace22和ppic9k-metbace46，通过电击法转入毕赤酵母gs115中，分别得到重组子9k-b22和9k-b46。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达，结果显示9k-b22的上清活性明显高于9k-b46的上清活性。9k-b22表达上清浓缩后经histrap亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的bace1活性,sds-page/高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白，并且其糖基侧链可以被endohf完全切除，得到50kda左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现，这两个蛋白分别与probace1和bace1匹配。活性检测发现糖基化bace1和去糖基化bace1的活性均低于hek-293细胞表达的商品bace1，这说明糖基化及其类型对bace1的活性非常重要。然而已知的bace1抑制剂对三者的抑制率无显著差异，这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化bace1纯化产量提高到1mg/l，这为发现并优化bace1新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。