山羊pthrp基因干扰重组腺病毒的制备与鉴定

甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroidhormonerelatedprotein，pthrp)具有广泛生物学功能，对调控钙代谢具有重要作用。采用rna干扰和重组腺病毒技术，对山羊乳腺上皮细胞中pthrp基因表达进行沉默，为进一步研究该基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定基础。采用block-itshrna腺病毒干扰系统，将设计好的寡聚shrna-322/357经退火复性后插入穿梭质粒pentr/cmv-gfp/u6中。经westernblotting检测干扰效率后，选择pentr/cmv-gfp/u6-322与病毒骨架质粒pad/pl-dest进行同源重组，成功获得重组干扰腺病毒载体pad/pl-dest/cmv-gfp/u6-322，并转染hek-293细胞，通过包装、扩增后产生干扰重组腺病毒ad-pthrp-322，tcid50法测定其滴度为2.0×109pfu/ml。用ad-pthrp-322感染山羊原代乳腺上皮细胞(moi=200)，经实时定量pcr及westernblotting检测表明在病毒感染24h、48h和72h后，山羊乳腺上皮细胞中pthrpmrna表达量分别下调了29.2％、68.1％和82.6％(p＜0.05)，其蛋白表达水平也明显下调，干扰效果明显。