粟酒裂殖酵母n-糖酰胺酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

根据genbank中公布的粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)n-糖酰胺酶(png1p)cdna序列,设计并合成一对特异性引物,利用rt-pcr技术从粟酒裂殖酵母中克隆出糖酰胺酶cdna。将得到的基因克隆到表达载体pet-15b中。重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)中,经诱导表达和纯化提取后,进行酶活测定。实验结果表明,该酶的分子量约为39kd,纯化后的重组n-糖酰胺酶可以对变性处理的糖蛋白进行糖链的切除,且这种作用需要还原剂dtt的辅助作用;n-糖酰胺酶只对错误折叠的糖蛋白有作用,对天然的糖蛋白没有作用。等量粟酒裂殖酵母png1p在不同温度、ph、dtt浓度和底物变性温度下对等量核糖核酸酶b(rnaseb)的脱糖基化检测发现,重组酶的最适反应温度30°c,最适反应ph为7.0,需要的最适dtt浓度为10mmol/l,底物在100°c处理10min时酶的脱糖基化率最高。