kozak序列+4g提高绿色荧光蛋白在hek293细胞中的表达

构建含不同kozak序列的绿色荧光蛋白(gfp)基因真核表达载体,并检测它们在hek293细胞中的表达差异。通过设计突变的pcr引物改变目的基因gfp的kozak序列,+4位碱基分别为a和g,且不改变氨基酸编码,将pcr扩增的gfp片段与载体pcdna3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的phgfp-a,phgfp-g质粒采用脂质体法转染hek293细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光表达,流式细胞术检测目的蛋白gfp的荧光表达阳性率,westernblot检测目的蛋白gfp的表达。构建的两质粒均能有效转染hek293细胞,其中流式细胞术分析显示:phgfp-a组gfp阳性率约为15%,phgfp-g组gfp阳性率约为45%;westernblot显示phgfp-g的gfp表达量约为phgfp-a的gfp表达量3.87倍。结果表明,kozak序列+4g(?3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用,可以使绿色荧光蛋白gfp在hek293细胞中的表达量提高约4倍。