牛ifn-γ原核表达、单克隆抗体制备及其elisa检测方法的建立

实验旨在建立牛重组ifn-γ（bovifn-γ）的elisa检测技术，为牛传染病的免疫学诊断提供新方法。pha刺激体外培养的奶牛外周血白细胞，从培养细胞中提取总rna,经过rt-pcr扩增出bovifn-γ基因cdna，进一步克隆至pet28a，转化大肠杆菌，经iptg诱导，表达出预期大小（18kd左右）组氨酸标记蛋白，经鉴定为bovifn-γ；以纯化的重组bovifn-γ为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得4株能稳定分泌抗bovifn-γ单克隆抗体的细胞株，分别命名为a7、a10、g6与g10。免疫球蛋白亚类鉴定证明杂交瘤细胞所分泌的抗体均为igg1，腹水效价在1∶210×100～1∶211×100之间。western-blot分析显示，4株单抗均能特异性结合重组bovifn-γ。elisa试验表明，4株单抗只与融合蛋白bovifn-γ反应，而不与非相关性蛋白ag85b、esat-6-cfp-10、gm-csf等发生反应。选取a10细胞株分泌的单克隆抗体、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶（hrp）标记的羊抗兔igg，建立了检测bovifn-γ的双抗体夹心elisa方法。实验结果表明，此方法检测敏感性达到2ng/ml，特异性良好，为进一步建立灵敏、特异的病原感染诊断方法奠定了基础。