唐鱼b-actin基因近端和远端启动子的鉴定及其启动活性分析

利用高保真pcr技术获得唐鱼(tanichthysalbonubes)长为1.3kb的b-肌动蛋白(b-actin)近端启动调控序列(ta,1.3kb)。在此基础上采用基因组步移技术(genomewalker)获得5￠侧翼上游序列1.7kb,再根据所获的近端启动子序列和上游序列设计引物,扩增获得全长为3.0kb的唐鱼b-actin基因远端启动调控序列(tla,3.0kb)。此1.3kb和3.0kb启动调控序列均包含3个转录活性元件:caatbox(-89~-85),cargbox(-59~-49),tatabox(-26~-20)。利用启动子分析软件transfac6.0分析,结果显示启动调控序列(-105~1261)中含有e-box、nf-y、sp1等多个重要转录因子结合位点,在远端启动调控序列(-1719~1261)中还含有更多的重要转录因子结合位点。将这两个序列分别定向克隆到红色荧光蛋白(redfluorescentprotein，rfp)表达载体中,构建重组表达载体ptla-dsred和pta-dsred,并分别注射到唐鱼受精卵中,结果显示转ptla-dsred基因唐鱼的阳性率较转pta-dsred的高,且所发出的红色荧光的强度也比后者的强。采用rt-pcr检测孵化后第15天的转基因唐鱼中rfp的mrna,结果显示转ptla-dsred基因唐鱼中rfpmrna的表达量比转pta-dsred基因唐鱼高35.7%。结果表明两种长度的启动调控序列均能有效驱使外源基因在唐鱼体内表达,且长度为3.0kb的启动子序列具有更强的驱动活性。