蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析

赖氨酸脱羧酶(lysinedecarboxylase,ldc)是抗老年痴呆药——石杉碱甲生物合成的第一个酶。为了研究蛇足石杉中ldc的特性和功能，以其总rna为模板，通过rt-pcr扩增得到2个赖氨酸脱羧酶基因ldc1和ldc2，克隆至pmd?19-t中测序发现，两基因同源性为95.3%，分别编码212和202个氨基酸。将两基因引入pet-32a(+)构建重组表达质粒pet-32a(+)/ldc1和pet-32a(+)/ldc2，分别转入bl21(ed3)中进行诱导表达，在30℃条件下获得可溶性表达产物trx-ldc1和trx-ldc2；采用ni-nta亲和层析法纯化目的蛋白，建立酶促反应体系分析其脱羧酶活性，薄层层析(tlc)检测表明重组融合蛋白trx-ldc1和trx-ldc2均能催化赖氨酸脱羧生成尸胺。利用生物信息学软件分析发现ldc1和ldc2理化性质存在差异，但预测的二级结构和三维结构基本一致。