蛋白激酶d1催化结构域在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化和活性测定

蛋白激酶d(proteinkinased,pkd)是一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(diacylglycerol,dag)受体，参与细胞内多种生理生化过程。为获得高纯度的pkd1的催化结构域(pkd1-cat)用于晶体学结构的研究，将带有gst标签的pkd1-cat基因克隆到杆状病毒转移载体pfastbac1中，构建了重组质粒。将重组质粒转化到含穿梭载体bacmid的dh10bac感受态细胞中，转座后获得了含目的基因gst-pkd1-cat的重组bacmid。重组bacmiddna转染sf9昆虫细胞后，获得重组杆状病毒并扩毒。将毒种以5pfu/cell的感染复数感染悬浮培养的t.ni昆虫细胞，sds-page和westernblotting检测表达产物。结果显示，表达产物在分子量约68kda处有一特异条带可与gst单克隆抗体发生反应。经谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化和prescissionprotease切除gst标签后，得到了纯度很高的分子量约42kda的目的蛋白pkd1-cat。体外pkd激酶活性实验结果显示，随着pkd1-cat浓度的增加，激酶活性增高。这些结果显示截短的重组pkd1-cat有很高的催化活性和纯度，为采用核磁共振或晶体学方法解析pkd1-cat的三维结构奠定了基础。