一种通用型piggybac转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证

为了构建一种高效、通用的细胞永生化载体ptp-htert，通过人工合成、pcr、酶切连接等方法，对传统piggybac(pb)转座子系统进行改造。改造后的载体含有转座必需元件、pb转座酶(pbase)表达框、共表达筛选元件和人端粒逆转录酶(htert)基因表达框。其中筛选元件中绿色荧光蛋白(egfp)基因和嘌呤霉素抗性(puror)基因以猪捷申病毒2a自我剪切肽相连，以实现共表达。为验证载体元件功能，使用该载体转染hek293细胞，并对筛选出的阳性细胞进行rt-pcr、westernblotting(wb)、热不对称pcr(tail-pcr)和细胞克隆亚甲蓝染色与统计分析。载体测序鉴定与细胞培养结果表明，通用型永生化载体ptp-htert构建成功，转染hek293细胞后能筛选出抗嘌呤霉素细胞单克隆；wb结果显示p2a可高效切割egfp和puror融合蛋白，证明筛选标记基因功能正常；tail-pcr结果表明该载体以转座整合插入宿主基因组；亚甲蓝染色统计结果显示由ptp-htert引发的细胞阳性克隆数与对照组相比显著提高(p<0.01)。pb转座子永生化载体ptp-htert的构建为永生化细胞系的建立提供了工具，同时也为其他真核载体的构建和改造提供了参考。