表达3-甾酮-△1-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

构建分枝杆菌表达载体pmtac并在分枝杆菌mycobacteriumneoaurumjc-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(ksdd)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(add)的产量。将pmf41的启动子pace替换成tac启动子构建载体pmtac，在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(gfp)和关键酶ksdd，通过gfp亮度和ksdd酶活验证tac启动子在m.neoaurumjc-12中的效果，并发酵验证加强表达ksdd对产物add的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在m.neoaurumjc-12表达gfp，但tac启动子的效果比pace强。酶活测定结果为重组菌m.neoaurumjc-12/pmtac-ksdd破碎细胞上清液中ksdd酶活比原始菌提高了6.53倍，比m.neoaurumjc-12/pmf41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌m.neoaurumjc-12/pmtac-ksddadd的产量比原始菌提高了22.2%，由4.86g/l提高到5.94g/l，而ad的产量由0.92g/l减少到0.17g/l，降低了81.5%；与m.neoaurumjc-12/pmf41-ksdd比，add产量提高了12.7%，ad降低了71.2%。以20g/l植物甾醇为底物，5l发酵罐中重组菌m.neoaurumjc-12/pmtac-ksdd的add产量达到10.28g/l。结果表明，构建的新型表达载体pmtac适用于在m.neoaurumjc-12中加强表达关键酶ksdd，而且在m.neoaurumjc-12中过量表达ksdd有助于add产量的提高，为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成add的最高水平。