豹蛙抗瘤酶的毕赤酵母高效表达、纯化及活性测定

豹蛙抗瘤酶(onconase，ranpirnase，onc)对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用，是当前全球重点研究的100种新药之一，为获得高表达与高活性的重组豹蛙抗瘤酶(recombinationonconase，ronc)，根据成熟onc的cdna序列和毕赤酵母密码子偏好性设计基因并提高其gc含量，分泌信号肽采用酵母α交配因子的pre肽，分别构建表达载体ppic9/onc、ppic9k/onc和ppiczα-a/onc，并转染毕赤酵母x-33、gs115和smd1168，筛选阳性克隆并进行诱导表达。在摇瓶规模筛选最佳载体-宿主组合及优化培养条件之后，进行10l规模最优培养基的筛选，发酵产物经双水相萃取偶联g50凝胶层析分离纯化。结果表明，ppiczα-a/x-33/onc组合表达量优于其他组合，且在ph5.5、23℃条件下诱导7d，最高表达量达到13mg/l；在10l规模条件下，ronc于ph5.5的低盐基础培养基(lowerbasicsaltmedium，lbsm)、甲醇浓度0.25%条件下诱导7d，最高表达量为180mg/l；纯化后的ronc纯度≥95%，收率高于90%；生物活性检测发现，ronc在体外能杀伤多种癌细胞。初步建立了ronc的高效表达与纯化体系，为后续的功能和作用机理研究奠定了一定基础。