大鼠cxcr4基因rnai慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

为深入研究cxcr4在骨髓间质干细胞(mscs)体内迁移中的作用,构建cxcr4基因rna干扰(rnai)慢病毒载体并实现其在大鼠mscs(rmscs)中表达。根据大鼠cxcr4mrna序列,设计并合成包含各靶序列的互补dna链,插入psuper载体的h1rna启动子后面,产生pricxcr4,将其中的cxcr4shrna表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pnl-egfp,产生pnl-ricxcr4-egfp。在脂质体介导下与包装质粒phelper和包膜质粒pvsvg共转染293t细胞,包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rmscs后,用real-timert-pcr、westernblotting和流式细胞术检测rnai组(cxcr4a、cxcr4b和cxcr4c)、空载体组(mock)和对照组(control)中cxcr4表达情况。结果显示,酶切和测序证实pricxcr4质粒构建正确,产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(egfp)和cxcr4shrna的慢病毒载体质粒pnl-ricxcr4-egfp,未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104tu/ml和6.9×106tu/ml。慢病毒转导rmscs48h后,与空载体组和空白组相比,3个rnai组均不同程度抑制cxcr4表达,cxcr4b-msc组在mrna水平抑制了95.6%,抑制作用最明显。大鼠cxcr4基因rnai慢病毒载体构建成功,为深入研究cxcr4在rmscs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。