抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定

为构建克伦特罗(clenbuterol,cbl)单链抗体(scfv)表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以pcantab5e-cbl质粒为模板,扩增cbl的scfv基因,与ppiczaa载体重组,然后以重组质粒ppiczaa-scfv为模板扩增scfv及其相连的6个组氨酸(6×his)片段,再与载体pbv220连接,转化大肠杆菌dh5a,阳性克隆质粒经酶切和pcr鉴定后进行目的片断的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体,并通过sds-page和westernblotting对其鉴定。采用竞争elisa检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pbv220-scfv含有插入片段,与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37kd,能够被抗his标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的cbl竞争性抑制,ic50值为4.55ng/ml。这说明我们成功构建了重组质粒pbv220-scfv并实现了其在大肠杆菌中的表达,为进一步进行cbl免疫法快速检测奠定了一定的基础。