人激肽释放酶-1在甲醇酵母中高水平表达、纯化与鉴定

将自肾脏cdna中获得的人激肽释放酶-1(humankallikrein1,hk1)基因插入到ppiczαa载体中,构建甲醇酵母分泌型表达载体ppiczα-hk1,该载体转化毕赤酵母(pichiapastoris)宿主菌x33,通过提高ypd平板和培养液中抗生素zeocin的浓度(500~700μg/ml),筛选能高水平表达重组人激肽释放酶-1(recombinanthumankallikrein1,rhk1)的p.pastoris工程菌株。在30l发酵罐中发酵的表达条件为30oc、ph6.0,诱导64h时,发酵上清中rhk1产量达到6500u/l(约1.25g/l)。表达的rhk1有n-型糖基化程度不同的两种类型,分别是分子量偏大的rhk1-h和分子量略小的rhk1-l。通过苯基疏水作用、cu2+螯合以及阴离子交换层析纯化,从每升发酵上清中可获得0.28g的rhk1-h和0.62g的rhk1-l,纯化的总得率约为72%,纯度不低于96%。到目前为止,该研究获得的rhk1产量高于其他研究者的结果。