人dna拓扑异构酶ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

为了在体外以人dna拓扑异构酶ⅰ（htopoⅰ）为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选，用rt-pcr法从hela细胞中克隆了htopoⅰ基因orf并在毕赤酵母中首次成功表达，表达产物可分泌到发酵上清，易于制备。蛋白酶a缺陷的重组酵母（smd-htopoi）分泌重组酶的能力比具有蛋白酶a活性的重组酵母（x33-htopoi和kmhtopoi）更高。通过发酵条件的优化，使用bmmy（ph7.25），于20℃，每隔24h补加0.5%(v/v)的甲醇和3%(v/v)的营养液，smd-htopoⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力（43000u/ml），发酵上清中htopoⅰ可达11mg/l，约占总蛋白的10%。sds-page和westernblot分析显示，表达的htopoⅰ为91kd蛋白，无糖基化修饰。