降低mrna翻译起始区的稳定性原核非融合表达hab18gef

为在大肠杆菌中非融合表达肝癌相关抗原hab18g胞外区片段（hab18gef），将hab18gef基因的cdna插入原核表达载体pet21a+。通过计算机辅助设计，对重组的hab18gef/pet21a+的mrna翻译起始区（tir）的二级结构和密码子偏性同时进行预测。结果发现其存在稳定的茎环结构和许多稀有密码子。通过优化二级结构和优化密码子偏性二种策略分别来降低hab18gef/pet21a+的mrna翻译起始区（tir）的稳定性。在不改变氨基酸序列的前提下，利用密码子的简并性，通过非连续定点突变实现这两种优化。将突变前后的重组子经酶切鉴定和测序验证后，转化感受态jm109de3宿主菌后，随机挑菌37℃下用iptg诱导表达。sdspage、间接elisa、westernblot和细胞分级分离法分析这些重组子的诱导表达情况。rnadotblot对比分析优化前后目的基因mrna的量。结果证明，成功地构建了hab18gef/pet21a+及其二种优化突变体。仅优化tir区二级结构或仅优化tir区密码子偏性均能实现hab18gef蛋白的非融合表达，而未优化的重组子不表达任何hab18gef。非融合表达产物在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在，高达293%。由于过表达和细胞渗漏，培养基和周质腔中也可检测到少许的hab18gef。优化二级结构和优化密码子偏性二种策略的hab18gef的非融合表达量基本相同。优化前后hab18gef转录的mrna量没有差别。这些结果表明，降低mrna翻译起始区的稳定性可实现肝癌相关抗原hab18g胞外区片段在大肠杆菌中的非融合表达。