cho/dhfr-细胞定点整合高效表达系统的建立

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果，我们尝试建立基于定点整合的cho高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pmcescan。该载体含有报告基因(k2tpa)、扩增基因（dhfr）、重组酶识别序列(frt)及筛选基因（neo），且neo基因的表达经过系统的弱化，确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染cho/dhfr－细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆，并对阳性克隆进行系统分析，筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆，此克隆被认为筛选载体整合入cho细胞基因组中转录热点（hotspot）区域，从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的cho/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统（flp-frt）将外源基因定点整合到hotspot区域，以实现外源基因在cho细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tpa的高表达，表达量达到17.1μg/106cell·24h。该研究致力于cho细胞基因组中高表达位点的寻找和确认，建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。