dna重组酶flp原核表达与多步法纯化及其活性检测

dna重组酶flp存在于酵母2μ质粒上，能识别34bp的frt位点，并根据2个frt位点的相对方向完成位点间dna序列的交换、重组、删除与逆转，在现代分子生物学理论研究与基因工程技术开发中具有广泛应用。构建了在原核大肠杆菌中高效表达flp重组酶的表达载体pqe32-flpe并建立起相应的原核高效表达体系，在原核细菌大肠杆菌m15菌株中实现flp酶蛋白的高效表达，同时建立了相应的纯化方法。纯化时先用硫酸铵沉淀法富集flp酶蛋白，经透析脱盐后再用镍离子鳌合微柱（0.5～1.0ml）亲合层析梯度洗脱的方法获得纯化的flp酶蛋白。通过构建含有2个方向相同的frt序列位点的质粒puc18-frt-gfp-frt和含有1个frt位点的表达载体pet30a-frt，并分别以其为底物来检测flp重组酶的删除、交换与重组功能的活性。结果表明，该方法不仅能有效表达flp酶蛋白，并能行之有效地纯化flp酶蛋白，以及检测纯化的flp酶蛋白对dna序列的删除、重组与交换功能。该方法简单易行并能获得有活性的flp酶蛋白，为深入研究其机理以及研发相应的dna重组技术提供重要参考。