k55r与ep8叠加突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的改善

利用重叠延伸pcr对扩展青霉脂肪酶（pel）基因进行体外定点突变，构建了k55r与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pao815-ep8-k55r。将该质粒电转化引入毕赤酵母（pichiapastoris）gs115，进行异源表达。实验结果表明：该叠加突变体在毕赤酵母中获得了活性表达，得到表达产物脂肪酶pel-ep8-k55r-gs。其表达量为508u/ml,分别约为野生型脂肪酶pel-gs（627u/ml）的81％，随机突变脂肪酶pel-ep8-gs（924u/ml）的55%；其比活力为2309.1u/mg,与随机突变脂肪酶pel-ep8-gs和野生型脂肪酶pel-gs的相仿。叠加突变脂肪酶pel-ep8-k55r-gs的最适作用温度为37℃,与野生型脂肪酶pel-gs和随机突变脂肪酶pel-ep8-gs一致；其tm值为41.0℃，比野生型脂肪酶pel-gs提高了2.3℃，比随机突变脂肪酶pel-ep8-gs提高了0.8℃。表明叠加突变脂肪酶pel-ep8-k55r-gs的热稳定性有了进一步的提高。