h-2db四聚体的制备及其在检测lcmv特异性cd8+t细胞中的应用

mhc四聚体技术是研究抗原特异性淋巴细胞应答的关键技术之一。为研究h-2db基因型(如c57bl/6)小鼠的特异性cd8+t细胞免疫应答,需要建立h-2db四聚体制备技术平台。首先以rt-pcr方法克隆h-2db重链基因的cdna,进而构建h-2db胞外域与生物素化酶bira底物肽(bsp)融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。在lcmvgp33-41抗原肽(kavynfatc,kav)和人β2-微球蛋白存在时,通过稀释法复性获得h-2db/kav单体。该单体经生物素化并纯化后与pe-链亲和素按4:1的比例混合,即形成四聚体。通过流式细胞术检测经kav肽免疫的c57bl/6小鼠体内的lcmv特异性cd8+t细胞的频率,结果表明在外周血、引流淋巴结和脾脏中均可检测到一定频率的lcmv特异性cd8+t细胞,其中以对外周血标本染色的效果最佳。成功建立了小鼠h-2db四聚体制备技术平台,为监测及分析基于h-2db基因型小鼠的实验性免疫治疗创造了条件。