gabarap克隆表达及其抗体的制备与应用

gabarap(gabaa-receptor-associatedprotein)是最新发现的与gabaa受体g2亚基胞内区有相互作用的蛋白,目前的研究结果表明它可能是通过与微管相互作用辅助gabaa受体向细胞膜上运输并使受体在膜上聚集。本文中用pcr方法扩增出编码人gabarap(hgabarap)的cdna片段,然后分别克隆到真核表达载体pcdna6/ha和谷胱甘肽转移酶(gst)融合蛋白表达载体pgex4t2中。将后者导入大肠杆菌bl21中,经过iptg诱导后用谷胱甘肽偶联的sep-harose-4b柱子纯化出融合蛋白gst-hgabarap。以此蛋白作为抗原免疫家兔制备抗gabarap的抗血清,并用gst-hgabarap耦联的nhs-activatedsepharose4柱子纯化抗体。纯化的抗体可以用于真核细胞中过量表达hgabarap的western和免疫染色检测。结果表明,过量表达的hgabarap在真核细胞核和细胞质中都有表达,部分集中于核周区域。