定向进化-易错pcr方法提高华根霉rhizopuschinensiscctccm201021脂肪酶的活力

运用定向进化-易错pcr的方法,提高了华根霉rhizopuschinensiscctccm201021脂肪酶的活力。经过两轮易错pcr和pnpp顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:a129s、k161r、a230t、k322r。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变a129s、k161r、a230t位于脂肪酶分子表面。突变a230t增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变k322r处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的km值比发菌株下降了10%,kcat值提高为原来的2.75倍。