猪圆环病毒2型双拷贝感染性dna的构建及体外拯救

感染性分子克隆是研究病毒复制和致病机制的有力工具。本研究应用pcr诱变技术解决了外源片段易于自连的难题,成功将2个pcv2sd1株全基因组(dq346683)头尾相接插入到真核生物表达载体psk的多克隆位点中,构建重组质粒psk-2pcv2;另外课题组成功构建含单个pcv2全基因组的psk-pcv2和自身环化质粒ds-pcv2。将所得3种质粒分别转染无pcv污染的pk-15细胞系,经10次连续传代后,间接免疫荧光试验检测显示三者均在细胞核中聚集大量的病毒抗原;经rt-pcr检测都有pcv2特异性基因转录;透射电镜下可观察到直径约为17~20nm的典型pcv2病毒粒子;经测序鉴定所拯救出的病毒与亲本病毒核苷酸同源性为100%。拯救出的pcv2与亲本病毒具有相同的病毒学及分子生物学特性。本研究应用pcr诱变技术成功构建pcv2双拷贝感染性克隆,并经体外拯救证实其具有感染性,为进行pcv2分子特性及致病机理研究打下了基础。