基因工程酶法结合酵母能量耦联高效合成l-谷氨酰胺的研究

通过pcr方法从bacillussubtilis基因组dna中扩增出谷氨酰胺合成酶基因(glna)，克隆至表达载体pet28b，经测序鉴定后转化大肠杆菌bl21(de3)，用iptg及乳糖诱导表达。sdspage分析表明，所表达的谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，简称gs)为可溶性蛋白，约占总菌蛋白的80％。利用表达的gs蛋白n端的6×histag对gs进行亲和层析，将获得的纯蛋白进行酶活性测定。结果表明，纯化的gs合成反应的最适温度为60℃，最适ph为6.5，mn2+能明显提高gs的活性和稳定性。工程菌bl21(de3)/pet28b-glna粗提物中gs的比活是宿主菌本身的84倍。以谷氨酸、nh4cl和atp为底物的转化实验表明谷氨酸的转化率达95％以上。经筛选获得一株高效能量耦联酵母菌株，命名为yc001；通过能量耦联表明，该系统对谷氨酸的转化率高达80％，平均谷氨酰胺产量为22g/l。