ht-pam基因在山羊β-酪蛋白基因座定位整合的研究

利用体细胞基因打靶与核移植技术制备动物乳腺生物反应器是当今转基因定位整合表达的一种新技术。分别克隆山羊的β-酪蛋白基因5′调控区的6.3kb片段，外显子7、外显子8和9三个基因片段，并与克隆的人tpa突变体cdna一起构建了含有neo和tk正负筛选标记基因的β-酪蛋白基因打靶载体pgbc4tpa，并验证了neo基因、tk基因以及cre-loxp系统的有效性。将线性化的pgbc4tpa通过电转染整合到山羊胎儿成纤维细胞基因组中，利用g418和ganc进行抗性细胞克隆的药物筛选，初步获得抗性细胞克隆244个，pcr检测后获得阳性细胞克隆31个，其中初步验证2个细胞克隆转植基因整合位点重组后的基因序列正确，并且该细胞克隆能够有效扩增。这为下一步基因打靶体细胞核移植制备山羊乳腺生物反应器奠定了基础。