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生物工程学报 2012
优化的反向pcr结合tail-pcr法克隆棉花线粒体atpa双拷贝基因及其侧翼序列, PP. 104-115 Keywords: 反向pcr,tail-pcr,细胞质雄性不育,棉花,atpa,双拷贝基因,侧翼序列 Abstract: 双拷贝基因及其侧翼序列的克隆是分子生物学中的一个难点。将优化的反向pcr(inversepcr,ipcr)与tail-pcr相结合,有效地克隆双拷贝基因及其侧翼序列。先用southernblotting方法确定一种能获得合适长度片段的限制性内切酶,然后用优化的ipcr方法对该酶切产物进行自连和扩增,将2个拷贝的侧翼序列区分开。根据ipcr结果,进一步用tail-pcr扩增更远侧翼的序列。利用这套方法,获得了棉花可育胞质和不育胞质线粒体双拷贝atpa基因的所有ecori限制片段(2.2~5.1kb)和hindⅲ限制片段(8.5~11.7kb),克隆到2个拷贝各自的侧翼序列。研究结果说明,优化的ipcr与tail-pcr相结合是克隆双拷贝基因及其侧翼序列的一种高效方法。
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