b族g蛋白偶联受体pac1可调控表达体系的建立

pac1是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptide，pacap)的特异受体，属于b族g蛋白偶联受体，介导pacap的神经递质、神经调质、神经保护、抗神经损伤及调控神经再生等功能，pac1高表达和神经损伤、肿瘤等生理病理过程密切相关。为了深入了解pac1的功能，构建pac1可调控表达的细胞系，通过优化的四环素控制表达系统实现pac1在中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary，cho)细胞的强力霉素(doxycycline，dox)依赖的可控表达。首先通过双酶切将编码pac1和增强型黄色荧光蛋白(eyfp,enhancedyellowfluorescentprotein)的融和基因pac1-eyfp克隆到ptre-tight载体上，获得重组载体ptre-pac1-eyfp；基因测序鉴定正确后将新型的四环素调节元件载体ptet-onadvanced和反应元件载体ptre-pac1-eyfp分别转入cho细胞中，g418和潮霉素(hygromycin)双抗筛选阳性克隆pac1-tet-cho，使用梯度浓度四环素类似物强力霉素dox诱导pac1-eyfp表达，48h后检测受体表达水平，并通过mtt法检测不同pac1表达水平的细胞增殖活性。荧光检测和western印迹结果显示，成功获得了具有良好诱导性的dox依赖的pac1可控表达的细胞系，这些细胞株在传10代后仍能稳定地可控表达pac1。mtt结果显示pac1表达水平越高，细胞增殖活性越强。成功所构建的dox依赖的pac1可控表达细胞系，为pac1的生物学功能的深入研究奠定了基础。