结核分枝杆菌cfp10、esat6、ag85a和ag85b抗原真核共表达载体的构建与表达

cfp10、esat6、ag85a和ag85b是结核分枝杆菌的主要免疫优势抗原。为了构建一种可同时表达这4种抗原的真核多基因共表达载体pcdna-cfp10-esat6-ag85a-ag85b(pcdna-ceab)，并利用hek293t细胞对其体外表达进行检测。采用酶切、连接的方法，将cfp10和esat6编码基因以(gly4ser)3蛋白linker连接，插入至质粒pcdna3.1(+)多克隆位点cmv启动子与加尾信号bghpa之间，使两者融合表达，将ag85a和ag85b编码基因以内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,ires)序列连接，并赋予rsv启动子和加尾信号bghpa，使两者在rsv启动子作用下独立表达。重组质粒经酶切及测序验证后转染至hek293t细胞中进行体外表达实验，48h后提取总蛋白，利用cfp10、esat6、ag85a和ag85b特异性抗体进行westernblotting检测。结果显示多基因共表达载体pcdna-ceab在真核细胞hek293t中得到表达，且cfp10、esat6、ag85a和ag85b抗原能被相应的特异性抗体所识别，表明质粒pcdna-ceab构建正确，这为进一步研究其免疫原性和免疫保护效果奠定了基础。