亚位点+1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性

通过改造来源于软化类芽胞杆菌paenibacillusmacerans的环糊精糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase,cgt酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性，并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-o-d-吡喃葡糖基-l-抗坏血酸(aa-2g)的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基leu194、ala230和his233分别进行定点饱和突变，得到3个优势突变体l194n(亮氨酸→天冬酰胺)，a230d(丙氨酸→天冬氨酸)，h233e(组氨酸→谷氨酸)，然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变，获得7个复合突变体。研究结果表明，突变体l194n/a230d/h233e以麦芽糊精为底物合成aa-2g的产量最高，达到1.95g/l，比野生型cgt酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析，发现高浓度的底物l-aa对突变型cgt酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、ph和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析，突变体底物特异性的改善可能与cgt酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。