重组阳离子抗肿瘤肽aik的原核表达、纯化及活性测定

利用gateway克隆技术构建重组抗瘤肽aik的原核表达体系，建立表达及纯化重组aik的最优条件，为深入研究和利用aik奠定基础。首先，设计含attb重组位点的引物，通过重叠pcr技术扩增出attb-tev-flag-aik序列，利用bp重组反应将目的序列tev-flag-aik克隆到供体载体pdonr223中，构建入门载体，再通过lr重组反应，将目的序列转移到目的载体pdest15中，构建gst-aik融合蛋白原核表达质粒。随后，在bl21(de3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化gst-aik融合蛋白，再以rtev酶切除gst，获得flag-aik重组蛋白。最后以mts法检测flag-aik对白血病细胞hl-60的细胞毒性。菌液pcr验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽aik的入门质粒和原核表达质粒。在bl21(de3)工程菌中实现了gst-aik融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1mmol/liptg诱导工程菌(od600=1.0)4h，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经gst亲和层析、rtev酶切除gst标签及二次gst亲和层析获得纯度高于95%的flag-aik蛋白。mts法测得所制备的flag-aik蛋白抑瘤活性与化学合成的aik相当。总之，本课题应用gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽aik的原核表达质粒，实现了gst-aik融合蛋白的高效可溶性表达，经亲和层析获得了有生物活性的重组aik多肽，为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。