n端二硫键对11家族木聚糖酶热稳定性的影响

以来源于米曲霉aspergillusoryzae的11家族常温木聚糖酶aoxyn11a为母本，将其n端替换成同一家族耐热木聚糖酶evxyn11ts的对应片段，构建出耐热杂合木聚糖酶aex11a。将aoxyn11a和aex11a基因分别在毕赤酵母gs115中进行表达并分析比较温度对表达产物酶活性的影响。结果表明，aex11a的最适温度topt为75℃，在70℃的半衰期t1/270为197min，较aoxyn11a(topt=50℃，t1/270=1.0min)显著提高。通过对aex11a结构的同源建模及其与aoxyn11a结构的比对，发现在aex11a的n端引入了一个二硫键(cys5–cys32)。利用定点突变法将其5位的半胱氨酸突变为苏氨酸(c5t)，去除该二硫键，以探讨其对aex11a热稳定性的影响。分析表明，突变酶(aex11ac5t)的topt由突变前的75℃降为60℃，其t1/270和t1/280也分别由197min和25min缩短为3.0min和1.0min。