耐热荧光素酶的表达及热稳定焦磷酸测序体系的建立

焦磷酸测序是一种基于生物发光反应的实时dna序列测定技术，其反应体系中的荧光素酶决定测序反应的灵敏度。传统焦测序反应使用的是野生型北美荧光素酶photinuspyralisluciferase(ppl)，该酶热稳定性较差，因此由该酶配制的焦磷酸测序反应体系对热不稳定，影响焦磷酸测序的灵敏度。为了建立热稳定的焦磷酸测序反应体系，全合成了耐热突变日本萤火虫荧光素酶的编码序列，并将其插入到表达载体pet28a(+)中构建重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌中，筛选得到的阳性重组菌成功表达了n端带有6×his(组氨酸)标签的耐热突变日本萤火虫荧光素酶。利用镍亲和层析法，纯化得到了分子量约为60kda且比活为4.29×1010rlu/mg的重组蛋白。对重组耐热日本萤火虫荧光素酶的热稳定性研究结果表明，该酶在50℃时仍具有活性，在40℃下孵育25min后活性保留了90％以上。与基于野生型北美荧光素酶的焦磷酸测序体系相比，由耐热日本萤火虫荧光素酶配制的测序反应体系对热稳定性有了极大的提高，该测序反应液在37℃放置1h后仍能够得到正确的测序结果。研究结果为建立稳定可靠的现场及时快速焦磷酸测序反应体系奠定了基础。