重组鱼腥藻脂肪氧合酶基因的克隆表达、分离纯化及活性分析

克隆鱼腥藻pcc7120基因组中脂肪氧合酶(ana-lox)基因，对该功能基因进行了定点突变研究，确定了ana-lox的最短功能基因长度，构建原核重组表达载体，对重组ana-lox进行了分离纯化和性质研究。从genbank中搜索到鱼腥藻pcc7120基因组中含有lox基因，通过序列分析和比对，发现lox功能基因位于双功能酶aos(单加氧酶)-lox的c端，通过定点突变研究，证实了ana-lox活性中心位点为his197、his202、his369、asn373和ile455。通过逐步缩短基因长度的策略，获得ana-lox基因的最短功能基因长度为1254bp。构建的表达载体pet-32a/ana-lox转化入bl21(de3)宿主内，在低温16℃条件下的诱导表达，重组脂肪氧合酶活力可达6750u/ml。表达产物通过ni-nta亲和柱进行分离纯化，比活达到11.4×104u/mg蛋白，酶活回收率为60.89％。重组ana-lox最适反应温度45℃，最适反应ph6.0，在常温下具有较好的稳定性，金属离子fe2+、mg2+、ca2+对该酶存在明显的激活作用，而fe3+和cu2+对该酶有强烈的抑制作用。重组ana-lox能够改善面团的显微结构。该研究获得了高效表达重组ana-lox，为实现其在食品加工中的应用提供了参考。