人il35-igg4(fc)融合蛋白在cho/dg44细胞中的稳定表达

本研究利用基因重组技术构建人il35-igg4(fc)融合基因真核表达载体,稳定转染cho/dg44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(pcr)从脂多糖(lipopolysaccharides,lps)诱导的人髓性白血病细胞株kg-icdna文库中克隆ebi3和il-12p35cdna,重叠pcr法连接2个片段,并克隆到igg4(fc)-poptivec?-topo?载体上,对新构建的il-35-igg4(fc)poptivec?-topo?真核表达载体并进行酶切、测序、pcr鉴定;脂质体法转染cho/dg44细胞;rt-pcr检测转染结果,采用a-mem-培养基筛选实验组细胞,对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤(methotrexate,mtx)的加压筛选,proteing-agarose纯化阳性克隆培养上清,免疫印迹检测目的蛋白表达。结果显示il-35-igg4(fc)poptivec?-topo?表达载体稳定转染cho/dg44细胞并获得阳性克隆;sds-page电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带;该蛋白能与羊抗人igg4抗体特异结合。本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的il35-igg4(fc)融合蛋白的cho/dg44细胞株。