双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

利用dna同源重组方法(基因打靶)对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体，本研究以pbs246质粒为骨架，在两个loxp序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo)基因和绿色荧光蛋白(egfp)基因；在两个loxp序列外侧分别插入两组携带“8碱基”酶切位点的多克隆位点序列(mcs-1和mcs-2)和负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)基因，构建成通用型基因打靶载体pgt-v1，并且在c2c12细胞中验证了载体中各个元件的功能。该载体具有如下特点：1)在载体中引入绿色荧光标记，可以实时监控载体的转染效率，而转染效率的提高为高效基因打靶提供了保证；2)在两个loxp位点间插入绿色荧光标记，可以直观监测打靶后遗留的筛选标记的去除情况，并且可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法，将最终去除了筛选标记的阳性细胞(即丢失绿色荧光的细胞)分选出来，降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响；3)采用“8碱基”酶切位点的mcs序列，便于dna大片段的连接和重组，极大提高了该载体的通用性。总之，该载体优化了基因打靶的技术手段，为有效开展基因打靶和转基因动物研究提供了新平台。