截短绿色荧光蛋白突变体反式剪接修复核酶

ⅰ型内含子核酶经过设计特定的信号引导序列（igs），可特异性地定点剪接目的基因rna，从而在rna水平达到修复病变基因的目的。以四膜虫材料，克隆了其26srrna内含子核酶基因，体外转录证实该i型内含子核酶具有完全的自我剪接的功能。为检测该核酶的反式剪接功能，构建了缺失后半段564bp基因序列的绿色荧光蛋白（gfp）的截短突变体重组质粒xyq5/xyq10pegfp-c-2，并证实其失去了发射绿色荧光的活性。利用pcr和分子克隆技术，构建了以上egfp突变体的反式剪接修复核酶ptrans-rib-cmv2，该核酶载体以克隆的26srna内含子为核心，选择egfp编码区194位tg为剪接位点，以188-193位设计igs序列，核酶3′端携带195-890bp的egfp基因序列，连接于prc-cmv2真核表达载体中。体外转录突变egfp的原核表达载体xyq5/10-pgem和ptrans-rib-cmv2，以混合转录产物为模板进行rt-pcr，电泳及测序证实产物中含有反式剪接修复的野生型egfpmrna，从而证实构建的反式剪接核酶具有体外反式剪接功能。将截短突变重组质粒xyq5/xyq10-pegfp-c2与核酶质粒ptrans-rib-cmv2共转染hela细胞，用荧光显微镜观察转染结果，发现有少量共转染的hela细胞发出绿光；rt-pcr检测出野生型egfpmrna，证明构建的反式剪接核酶具有体内反式剪接的功能，但其反式剪接效率低。