毕赤酵母基因操作技术的改进及其在水蛭素表达中的应用

毕赤酵母是日益受到重视的基因工程受体菌，但是目前尚没有一种简便、高效的转化方法，也没有一种稳定、可靠的菌落pcr方法。本文通过在通常筛选重组子的md培养基中增添1mol/l山梨糖醇使毕赤酵母电穿孔转化效率提高10倍以上。并比较系统地分析了其他影响电穿孔转化效率的因素，如毕赤酵母生长状况即od600，不同的整合位点(bglⅱ,sacⅰ,salⅰ,stuⅰ)，及不同的毕赤酵母受体菌(gs115和km71)等。本文描述的转化方法所能达到的转化效率比目前大多数文献报道的效率要高，可使每微克质粒dna产生的整合到受体菌染色体上的转化子述2800个；另外，我们经过一种冷热处理毕赤酵母菌落的方法使其细胞壁裂解，并改变通常pcr缓冲液的组成成分后，毕赤酵母菌落pcr方法几乎和大肠杆菌的操作一样简便可靠。借助本文所描述的电穿孔转化方法和菌落pcr方法，成功实现了水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达，表达量为每毫升培养上清20μg，其生物活性达每毫升培养上清82个国际单位。